本文是第二部分，承接《Cell子刊：噬菌体对肠道菌群和代谢组的调控（一）》。

2 噬菌体在哺乳动物肠道中减少靶向细菌的数量并与其共存，产生了易感细菌和抗性细菌的混合种群

Phages Knockdown and Coexist with Targeted Bacteria in the Mammalian Gut and Lead to Mixed Populations of Susceptible and Resistant Bacteria

我们试图在复杂但已知的肠道细菌群落中描述噬菌体及其靶向细菌的行为。
如图1A所示，我们用我们定义的细菌群落接种无菌小鼠(A. muciniphila 和P. mirabilis, 每种2 10 ⁶ cfu，其他每种2 10⁷ cfu)，然后引入噬菌体(每种噬菌体2 10⁶ pfu)，用来靶向细菌种群的子集。使用T4噬菌体和F1噬菌体分别靶向E. coli 和C. sporogenes ，接着使用B40-8噬菌体和VD13噬菌体分别靶向B. fragilis 和E. faecalis*。噬菌体成对施用，以探测多重同时扰动（multiple simultaneous perturbations）是否可能具有协同或抵消效应。每组噬菌体都包含针对兼性厌氧菌和专性厌氧菌的噬菌体，以减少潜在的一组噬菌体对另一组噬菌体的偏差。收集了一系列粪便样本，在施加噬菌体前后收集的频率更高，期望获得丰富的动态变化信息。

我们结合了定量PCR和高通量测序（next-generation sequencing techniques ）对检测噬菌体和细菌，从推算出噬菌体和细菌浓度。与所有高通量分子生物学方法一样，可能引入了以前已经记录过的与样品储存和DNA提取等因素相关的偏差。除此之外，我们还发现在细菌总浓度的推算中引入了偏差。为了减少这些偏差对我们结果的影响，我们利用我们研究的时间序列设计，主要分析个体物种随时间的变化(例如，施加噬菌体前后)。

我们的分析表明噬菌体和它们的靶向共生细菌都存在于肠道中。施加噬菌体4-6小时后，每种噬菌体都可以被检测到，之后在整个实验期间都可以被检测到(图1B)。先前的研究发现，持续缺乏易感细菌，无菌小鼠中的T4噬菌体，无法复制，在两天内脱落。鉴于这些结果，我们感兴趣的是确定在我们的系统中持续存在的细菌是否获得了对噬菌体的抗性。因为我们的细菌群落包含系统发育多样性的菌株和密切关联的菌株，如在天然肠道微生物群落中发生的，为了噬菌体抗性测定的需要从粪便中分离单个细菌物种是一项挑战。然而，使用选择性培养基，我们能够从粪便中分离E. faecalis，并测试其对VD13噬菌体的敏感性。

如图1C所示，在噬菌体施用前(第27.1天)和之后不久(第30.5天)，E. faecalis的分离株完全对噬菌体是易感的(敏感性极限，1.6%)。然而，在第2天(第32.3天)和第10天(第40.2天)后，分别发现28%和68%的被测菌落具有噬菌体抗性。当结合E. faecalis 浓度的变化考虑时，这些结果表明噬菌体定向敲低（knockdown）细菌(~ 2个数量级)导致噬菌体抗性亚群的富集。

3 噬菌体对非靶向的微生物群落的物种诱导产生级联效应

Phages Induce Cascading Effects in Species in the Microbiota Not Directly Targeted

对每种细菌物种的纵向跟踪表明，噬菌体捕食诱导微生物数量变化，包括对噬菌体不敏感的细菌物种。当根据估计的每个物种的浓度检查细菌组成时(图2A)，我们发现施加噬菌体会诱导群落中低丰度（abundance）和高丰度的物种发生转变。例如，在第16.1天施加第一组靶向E. coli 和C. sporogenes 的噬菌体后，低丰度物种B. vulgatus、P. mirabilis 和P. distasonis(~10 ⁶，估计的每g粪便中细菌数)和高丰度物种A. muciniphila 和 B. fragilis（(~10 ⁸ 估计的每g粪便中细菌数)都发现了可以观察到的转变。但第30.1天施加第二组噬菌体的作用不太明显，即使分别检查每个物种，变化依然不明显。第一组噬菌体与第二组噬菌体观察到的这些非常不同的效应突出了噬菌体效应的特异性，并且反对了噬菌体施加本身的任何系统性效应的说法(例如，口服灌胃或载体效应产生的压力)，这些发现都与之前的研究一致。

图2 噬菌体对共生肠道菌群的影响

Effect of Phage on the Commensal Gut Microbiota

(A)估算的粪便中的细菌丰度，下图是顶图的放大版本，用来展示低丰度的信息。来自单独饲养小鼠(n = 5)的每种细菌物种估算的细菌浓度的几何平均值显示在堆叠条形图中。y轴为线性刻度。

(B, C)每种细菌物种的丰度取对数变换(log₁₀)，数据来源于图2A，由第一组噬菌体(B)和第二组噬菌体(C)的施加而产生的变化。x轴代表噬菌体施加后经过的时间，当噬菌体施加时，垂直虚线划分 t = 0。

如图2B所示，为了量化噬菌体施加引起的细菌定殖的变化幅度，我们计算了每种噬菌体施加后与前一天相比，浓度的变化。我们发现，在第一组噬菌体施加期间，C. sporogenes 和E. coli 的敲低（knockdown）导致B. vulgatus，P. mirabilis 和A. muciniphila 快速且大量的繁殖，随后是P. distasonis 和B. ovatus 的逐渐扩张，以及B. fragilis 的逐渐减少。第二组噬菌体对周围微生物组的影响不太明显，E. coli 和C. sporogenes的扩张幅度最小，其他物种的波动接近基线。

尽管背景菌群有所变化，噬菌体捕食并没有消灭最初存在的物种。如图2A所示，在施加噬菌体后，没有细菌种类被完全消除。事实上，总细菌量没有明显变化。有人认为捕食者的存在会给生态系统带来更大的稳定性。在我们定义的微生物群落中的Bray-Curtis相异度（dissimilarity）显示，随着噬菌体的每次连续施加，小鼠之间和相邻时间点之间的相异度（dissimilarity）逐渐减小。这一现象间接表明，微生物群落在形成是一个更稳定的系统，表明噬菌体捕食可能有利于增加细菌群落的稳定性。