类风湿性关节炎（RA）影响着全世界数千万人。临床上，RA被认为是一种进行性的、炎症性的和自身免疫性的疾病，主要影响关节，通常有四个阶段。(1) 在第一阶段，关节滑膜发炎，大多数人有轻微的症状，如醒来时的僵硬；(2) 在第二阶段，发炎的滑膜已造成关节软骨的损害，人们开始感到肿胀，活动范围受限。(3) 在第三阶段，RA已经发展到严重的状态，骨质开始侵蚀，骨头表面的软骨已经退化，导致骨头互相摩擦；(4) 在第四阶段，某些关节严重变形，失去功能。为了抑制RA的发展，有必要对不同RA阶段的人采取特定的治疗策略。

本文研究介绍的是华中科技大学生命学院宁康教授团队与山东第一医科大学韩金祥教授团队、山东大学张磊教授团队合作，在风湿病学排位第一的国际顶尖期刊《Annals of the Rheumatic Diseases》(IF 27.973)在线发表了合作研究的新成果，文章题为“Stage-specific roles of microbial dysbiosis and metabolic disorders in rheumatoid arthritis”。该研究结果认为，临床微生物干预应考虑RA阶段，微生物菌群失调和代谢紊乱呈现不同的模式，并发挥阶段性的作用。这为从阶段的角度理解肠道-关节轴提供了一个新的见解，这为RA的预后和治疗开辟了新的途径。

主要结果

数据。该研究是多组学研究，研究的数据收集在山东第一医科大学第一附属医院（中国山东济南）。2017年至2020年，共收集了山东第一医科大学第一附属医院122名门诊患者的122份粪便和122份血浆样本。这些门诊患者包括76名RA患者、19名OA患者和27名健康人。根据类风湿诊断评分3，将RA患者分为四期，包括RAS1（n=15）、RAS2（n=21）、RAS3（n=18）和RAS4（n=22），其中RAS1、RAS2、RAS3和RAS4的评分分别为6-7、8、9和10。该分数由2010年RA分类标准中总结的四个类别的总和来评估。收集粪便样本并进行测序，血浆样本用于检测血浆代谢物、抗瓜氨酸蛋白抗体、红细胞沉降率、C反应蛋白、类风湿因子、细胞因子和血浆代谢物。

RA阶段特异的微生物。与健康对照组相比，在RA进展过程中，升高的物种主要来自厚壁菌门和放线菌门，而减少的物种主要来自拟杆菌门。几个重点关注的细菌：Collinsella aerofaciens只在RAS1中升高，RAS1中Collinsella aerofaciens的升高可能有助于早期肠道屏障完整性的破坏，通过这种破坏，微生物产物的转移会引发随后的临床关节炎。此外，Veillonella parvula（其感染可引起骨髓炎）只在RAS3中被发现升高）。在RAS4中发现Eggerthella lenta和Bifidobacterium longum单独升高。据报道，灌服E. lenta会增加肠道的通透性，并产生促炎症细胞因子。还认识到OA中专门改变的物种，如升高的Dialister invisus，与脊柱关节炎的严重程度呈正相关。

RA阶段特异的微生物功能。在四个RA阶段和OA中，糖胺聚糖（CAG）的代谢明显下降。这主要体现在硫酸皮肤素（DS）降解的K01197（透明质酸酶）和硫酸肝素（HS）降解的K10532（肝素-α-氨基葡萄糖N-乙酰转移酶）的明显下降（P<0.05，图1A）。4-硫酸软骨素是许多结缔组织的细胞外基质的主要成分，如软骨、骨骼和皮肤。结果发现，DS降解的显著耗竭会抑制4-硫酸软骨素的产生（图1B），这可能会损害关节软骨的机械性能。

此外，HS降解的显著下降可能是在RA和OA患者中观察到的较高血浆HS水平的潜在原因，这可能通过调节蛋白酶活性促进关节炎的发展。与K01197有关的MGS B. uniformis的基因在RAS2中被发现耗竭最多，而与K10532有关的MGS B. plebeius的基因在RAS3和RAS4中被发现耗竭最多（图1B）。这些结果表明，由B. uniformis和B. plebeius分别驱动的DS降解和HS降解的微生物功能耗尽，可以促进RA和OA的方式伤害关节软骨。还确定了与炎症有关的微生物功能的升高，如以前报道的抗坏血酸降解。大多数与抗坏血酸降解有关的KO在整个RA阶段和OA中保留了较高的水平，特别是在RAS2和RAS3（图1A）。

微生物对关节滑液的侵入。肠漏的增强可能使微生物及其产物有可能转移，从而引发免疫反应。因此推测肠道微生物可能通过肠道-关节轴侵入RA患者的关节滑液。为了验证这一点，对另一组271名不同阶段RA患者的滑液样本进行了16S rRNA基因测序。值得注意的是，无法在RAS1、RAS2或RAS3的样本中获得足够的细菌DNA进行测序，然而，可以在RAS4的样本中识别许多微生物。结果发现，关节滑液中的大多数微生物来自变形杆菌门和厚壁菌门，在粪便宏基因组数据中也可以检测到总共98个属。在每个RA阶段随机选择6个滑膜液样本进行细菌分离。只有从RAS4的三个滑液样本中才能分离出细菌。然后，在每个滑液样品中挑选并测序了三个单菌落。9个菌落中有5个被鉴定为孢子梭菌菌株，3个被鉴定为Enterococcus gallinarum菌株，1个被鉴定为Citrobacter freundii菌株。有趣的是，在18%的RA患者的粪便宏基因组数据中也可以检测到Enterococcus gallinarum和Citrobacter freundii。

用扫描电子显微镜观察了相应的滑膜液样本，发现了形状像细菌的棒状或球形的物质（图2）。综上所述，这项多方面的调查提供了前所未有的证据，支持RA第四阶段存在微生物对关节的入侵。

RA阶段特异的代谢组学特征。引入代谢组学数据，对232个微生物组物种、6224个KO和277个代谢物进行随机森林算法，以测试它们对RA和OA各阶段的诊断潜力（图3A-E）。代谢物在区分四个RA阶段的样本或OA与健康样本时表现出最佳的接收者操作特征曲线下面积（AUROC），AUROC范围为0.974至0.998。其他物种和KO水平的特征表现出较弱的鉴别能力，AUROC分别为0.760至0.838，0.799至0.852。代谢物最突出的变化是RAS1中DL-乳酸和gly-glu的显著增加，RAS2中N,N-二甲基苯胺的减少和甲氧基乙酸的增加，RAS1中半胱氨酸-S-硫酸的增加，RAS4中半乳糖醇和3α-甘露糖的增加，以及与健康状态相比，OA中N,N-二甲基苯胺的减少和甘露的增加。主要的代谢紊乱暗示了对发病机制的关键参与和对RA阶段的巨大诊断潜力。

此外，代谢不仅可以将一个特定的RA阶段与健康对照组区分开来，还可以将其他RA阶段或OA区分开来（图3F）。RAS2的甲氧基乙酸或RAS3的半胱氨酸-S-硫酸或RAS4的半乳糖醇和3α-甘露糖，分别高于所有其他RA阶段和OA。此外，半胱氨酸-S-硫酸是谷氨酸的结构类似物，作为N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDA-R）的激动剂，其在破骨细胞中的表达和功能参与骨吸收。因此，RAS2中甲氧基乙酸的明显升高可能会阻碍成骨细胞，而RAS3中半胱氨酸-S-硫酸的明显升高可能会鼓励破骨细胞。成骨细胞和破骨细胞之间的不平衡会促进临床上发生在RA第三阶段的骨侵蚀。此外，OA中的DL-乳酸盐低于所有RA阶段，这可能改善早期RA与OA的临床区分。

结论

该研究结果揭示了肠道微生物组和血浆代谢组的动态变化，以及它们在RA四个连续阶段的发病机制中的持续作用（图4）。此外，研究证明微生物对关节滑液的入侵发生在RA的第四阶段。

临床微生物干预应考虑到RA的阶段。研究发现每个RA阶段都有其特殊的升高或下降的微生物，在RA的发病机制中起作用（图4A）。因此，像许多研究一样，在没有阶段信息的情况下，一般报告RA的微生物改变，可能不足以作为临床指导。此外，在第二和第三阶段抑制大肠杆菌可以帮助维持L-精氨酸的含量，作为骨质流失的抑制剂，以及抗炎的抗坏血酸的含量。此外，某些物种可能需要跨阶段的干预，因为在整个RA进展过程中它被消耗了。跨阶段恢复B. uniformis可以帮助维持4-硫酸软骨素的含量，以保持关节软骨的机械性能。此外，在整个RA的发展过程中，代谢的改变是相当大的，尽管如此，研究发现其中某些代谢物在特定阶段需要更优先的干预。在RA的第二阶段，甲氧基乙酸的异常升高可能对成骨细胞有抑制作用，导致骨髓细胞的减少28-30（图4B）。被抑制的成骨细胞为下一阶段发生的骨质侵蚀提供了预兆。在第三阶段，相当高的半胱氨酸-S-硫酸可能通过NMDA-R相互作用增强破骨细胞。因此，甲氧基乙酸可能是治疗RA第二阶段患者的目标代谢物，并作为即将到来的第三阶段的预防措施。

参考文献：

Cheng M, Zhao Y, Cui Y, et alStage-specific roles of microbial dysbiosis and metabolic disorders in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases  Published Online First:  19 August 2022. doi: 10.1136/ard-2022-222871